Международен екип от учени от САЩ, Франция и Китай създаде полусинтетична форма на живот. Въпреки че вече са правени опити за получаване на бактерии с модифицирана ДНК, микроорганизмите се размножават слабо, изискват специални условия за отглеждане и в крайна сметка се отърват от модификациите, въведени в тях. "Lenta.ru" разказва за нова работа, в която изследователите са успели да разрешат тези проблеми, след като са получили същество, което е коренно различно от целия естествен живот на Земята.
Съвсем наскоро ДНК на всички живи организми на нашата планета се състоеше от четири вида нуклеотиди, съдържащи аденин (А), или тимин (Т), или гуанин (G), или цитозин ©. Струни от десетки или стотици милиони нуклеотиди образуват отделни хромозоми. Гените, открити в хромозомите, са по същество дълги нуклеотидни последователности, в които са кодирани аминокиселинните последователности на протеините. Комбинацията от три последователни нуклеотида (кодон или триплет) съответства на една от 20 аминокиселини. По този начин животът използва трибуквен генетичен код (ATG, CGC и т.н.), базиран на четирибуквена азбука (A, C, T, G).
Когато една клетка на организма се нуждае от протеин (полипептид), генът, който го кодира, се включва. Последният е прикрепен към специален ензим, наречен РНК полимераза, който по време на процеса на транскрипция започва да следва последователността на нуклеотидите и да създава негово копие под формата на молекула, наречена пратеник РНК (тРНК). РНК е много подобна на ДНК, но вместо тимин, тя съдържа урацил (U). След това тРНК напуска клетъчното ядро и се насочва към рибозомите, където по време на процеса на транслация служи като рецепта за създаване на аминокиселинната верига на протеина.
Изследователите решили да променят генетичния код на Escherichia coli, като добавят към него две допълнителни „букви“. Факт е, че ДНК в живите организми е двойна, тоест тя се формира от две вериги, които са сдвоени помежду си чрез допълващи се връзки. Такива връзки се образуват между основата на А-нуклеотида от едната верига и основата на Т-нуклеотида от другата (подобно между С и G). Ето защо двата нови синтетични нуклеотида също трябва да могат да се допълват взаимно. Изборът падна върху dNaM и d5SICS.
Е. coli Ешерихия коли
Снимка: Rocky Mountain Laboratories / NIAID / NIH
Една двойка синтетични нуклеотиди беше вмъкната в плазмид - двуверижна кръгла ДНК молекула, способна да се размножава отделно от останалата част от бактериалния геном. Те замениха двойка комплементарни нуклеотиди А и Т, които бяха част от лактозния оперон - набор от гени, които метаболизират лактозната захар, и некодиращите ДНК последователности, свързани с тях. Синтетичните нуклеотиди не бяха включени в областта, която полимеразата копира в иРНК.
Промоционално видео:
Защо учените решиха да не вмъкват синтетични нуклеотиди директно в гена, а до него? Факт е, че е много трудно да се промени ген по този начин, така че той да остане функционален. В края на краищата, за това трябва да свържете получените нови кодони с всяка аминокиселина. За това от своя страна е необходимо да научите клетката да произвежда различни видове транспортна РНК (tRNA), която може да разпознава тези кодони.
Молекулите на тРНК изпълняват следната функция. Те, подобно на камиони, носят определена аминокиселина в единия край, приближават се до иРНК в рибозомите и от своя страна започват да съвпадат с триплета нуклеотиди в другия край с кодона. Ако те съвпадат, аминокиселината се отстранява и се включва в протеина. Ако обаче няма подходяща тРНК, протеинът няма да бъде синтезиран, което може да повлияе отрицателно на жизнеспособността на клетките. Следователно, чрез въвеждане на синтетични нуклеотиди в гените, учените ще трябва да създадат гени, които кодират нови тРНК, които могат да разпознаят изкуствени кодони и да прикачат правилната аминокиселина към полипептида. Задачата на изследователите обаче беше по-проста. Те трябваше да се уверят, че плазмидът със синтетични нуклеотиди ще се размножава успешно и ще бъде предаден на дъщерните организми.
Плазмиди, използвани за трансформация на ешерихия коли
Изображение: Denis A. Malyshev / Kirandeep Dhami / Thomas Lavergne / Tingjian Chen / Nan Dai / Jeremy M. Foster / Ivan R. Correa / Floyd E. Romesberg / Nature / Department of Chemistry / The Scripps Research Institute
Този плазмид, обозначен като pINF, се въвежда в Е. coli. За да го копирате обаче, е необходимо много нуклеотиди да присъстват вътре в бактериалната клетка. За тази цел друг плазмид, pCDF-1b, беше вмъкнат в Е. coli. Той съдържа гена на диатомовия Phaeodactylum tricornutum PtNTT2, който кодира NTT протеина, който транспортира нуклеотиди от хранителната среда в клетката.
Учените обаче се сблъскаха с редица трудности. Първо, протеините на Phaeodactylum tricornutum имат токсичен ефект върху Е. coli клетката. Всичко заради наличието в тях на фрагмент от аминокиселинната последователност, който носи сигнална функция. Благодарение на нея протеинът заема правилната позиция в клетката на водораслите, след което последователността се отстранява. Е. coli не е в състояние да премахне този фрагмент, затова изследователите са й помогнали. Те успяха да премахнат първите 65 аминокиселини от NTT. Това значително намалява токсичността, въпреки че намалява и скоростта на транспортиране на нуклеотиди.
Друг проблем е, че синтетичните нуклеотиди се задържат в плазмидите дълго време и не се заменят при копиране на ДНК. Както се оказа, тяхната безопасност зависи от това какви нуклеотиди ги заобикалят. За да разберат, учените са анализирали различни комбинации, вградени в 16 плазмиди. За да разберат дали синтетичен нуклеотид е отпаднал от последователността, изследователите са използвали технологията CRISPR / Cas9.
CRISPR / Cas9
Изображение: Стив Диксън / Фън Джанг / MIT
CRISPR / Cas9 е молекулярен механизъм, който съществува вътре в бактериите и им позволява да се борят с бактериофагите. С други думи, тази технология представлява имунитет срещу вирусни инфекции. CRISPR е специално парче ДНК. Те съдържат къси фрагменти от ДНК вируси, които някога са заразили предците на днешните бактерии, но са били победени от тяхната вътрешна защита.
Когато бактериофагът навлезе в бактериите, тези фрагменти се използват като шаблон за синтез на молекули, наречени crRNA. Образуват се много различни РНК вериги, те се свързват с протеина Cas9, чиято задача е да отреже ДНК на вируса. Той може да направи това само след като crRNA намери комплементарен фрагмент от вирусна ДНК.
Ако вместо crRNA се използва РНК последователност, комплементарна на определен фрагмент от плазмида, Cas9 също ще отреже плазмида. Но ако във този фрагмент има синтетични нуклеотиди, тогава протеинът няма да работи. По този начин, използвайки CRISPR, е възможно да се изолират онези плазмиди, които са устойчиви на нежелани мутации. Оказа се, че при 13 от 16 плазмида загубата на синтетични нуклеотиди е незначителна.
По този начин изследователите успяха да създадат организъм с фундаментални промени в ДНК, способни да ги задържат в себе си за неопределено време.
Въпреки че полусинтетичната форма на живот има само два неестествени нуклеотида в генома си, които не се намират в кодоните и не участват в кодирането на аминокиселини, това е първият устойчив организъм, чиято ДНК азбука се състои от шест букви. В бъдеще учените най-вероятно ще могат да използват това нововъведение за синтезиране на протеини, като по този начин създават пълноценен изкуствен генетичен код.
Александър Еникеев