Генното инженерство отваря възможности за човечеството да създава несъществуващи преди това организми и да унищожава генетични заболявания. Нещата обаче не са толкова розови, тъй като дори пробивната технология CRISPR / Cas9 далеч не е перфектна. Грешките, които тя допуска, може да са редки, но една е достатъчна, за да стане фатална за човека. Lenta.ru говори за това какво не е наред с CRISPR и как учените се опитват да оправят ситуацията.
Системата CRISPR / Cas9 - вид ДНК ножици - с право се смята за революция в областта на генното инженерство. С негова помощ учените могат да редактират човешкия геном, премахвайки вредните мутации от него и по този начин да лекуват неприятни и смъртоносни наследствени заболявания. Не бива обаче да се мисли, че преди не е имало такива методи. В арсенала на генетиците бяха например нуклеази, съдържащи цинкови „пръсти“, и ендонуклеази - ензими, които разбиват ДНК молекулите на определени места. По отношение на точност, гъвкавост и цена те значително отстъпват на CRISPR / Cas9, въпреки че последният далеч не е перфектен.
CRISPR / Cas9 първоначално е създаден не от учени, а от природата. Това е молекулярен механизъм, който съществува вътре в бактериите и им позволява да се борят с бактериофагите и други паразити. Всъщност той действа като имунитет срещу инфекция. CRISPR (означава „кратки палиндромни повторения, редовно разположени на групи“) са специални области (локуси) на ДНК. Те съдържат къси фрагменти от ДНК вируси, които някога са заразили предците на днешните бактерии, но са били победени от тяхната вътрешна защита. Тези парчета се наричат дистанционни и се отделят един от друг чрез повтарящи се последователности.
Когато бактериофаг нахлуе в бактерия, всяка повтаряща се последователност и съседен дистанционер се използват като шаблон за синтеза на молекули, наречени crRNAs. Образуват се много различни РНК вериги, те се свързват с протеина Cas9, чиято задача е изключително проста: да изреже ДНК на вируса. Той обаче ще може да направи това само след като crRNA намери комплементарен фрагмент от вирусна ДНК. След като Cas9 разгражда чуждата нуклеинова киселина, последната се разрушава напълно от други нуклеази.
CRISPR / Cas9 е добър именно със своята точност, тъй като за бактериите правилното функциониране на имунната система е въпрос на живот и смърт. Системата "антивирус" трябва да намери част от вирусна ДНК сред милион други и най-важното да не я бърка със собствения си геном. В продължение на милиони години еволюция бактериите са усъвършенствали този механизъм. Така веднага след като разбраха защо е необходима система CRISPR, те осъзнаха, че тя може да бъде опитомена като безпрецедентно точен инструмент за редактиране на гени.
За да се замени една специфична област в генома с друга, е необходимо да се синтезира направляваща РНК, която по принцип е подобна на crRNA. Той казва на Cas9 къде е необходимо да се направи двуверижна пробив в ДНК на модифицирания организъм. Не е нужно обаче да разваляме гена, а да го модифицираме - например да заменим един или повече нуклеотиди и да премахнем вредната мутация. Тук природата отново идва на помощ. Механизмите за естествен ремонт веднага започват да възстановяват прекъснатата верига. Номерът е, че за това някои РНК фрагменти се отстраняват близо до прекъсването, след което там се вмъкват подобни последователности. Учените могат да ги заменят със собствени ДНК последователности и по този начин да модифицират генома.
Схематично представяне на CRISPR
Промоционално видео:
Изображение: Kaidor / Wikipedia
Нищо обаче не е идеално. Въпреки относителната си точност, CRISPR понякога допуска грешки. Една от причините се крие в самата природа на системата. Неблагоприятно е бактериите за crRNA да съвпадат на 100 процента с фрагмент от вирусна ДНК, която може да се различава с един или два нуклеотида. За нея е по-добре някои нуклеотиди да са различни, което дава на микроорганизма по-голям шанс за борба с инфекцията. В същото време в генното инженерство ниската специфичност заплашва грешки: промени могат да бъдат направени на грешното място. Ако това се случи в хода на експерименти с мишки, тогава няма да има особена трагедия, но редактирането на човешкия геном може да се превърне в катастрофа.
Това обяснява загрижеността на западните учени от експериментите, които се провеждат в Китай. Азиатски изследователи са използвали технологията CRISPR за генетична модификация на човешки ембриони. Подобни експерименти са забранени в Европа и Съединените щати, но наскоро Обединеното кралство ги разрешава - единствено с изследователска цел. Такива ембриони ще трябва да бъдат унищожени след няколко седмици след получаването им, което изключва „размножаването“на ГМ хора.
CRISPR / Cas9 обаче няма да е толкова страхотен, ако не може да бъде подобрен. И така, учените научиха Cas9 да реже не две вериги наведнъж, а само една. Разрязването се извършва на две различни места в ДНК последователността на различни вериги, така че системата трябва да може да разпознава два пъти повече нуклеотиди от нормалните, което я прави по-точна.
Протеин Cas и crRNA
Снимка: Томас Сплетстоер / Уикипедия
Учени от университета в Западен Онтарио са намерили друг начин да подобрят тази технология. Те се опитваха да решат проблема с възстановяването на изрязаната ДНК. Бързото възстановяване на веригата на нуклеиновите киселини води до факта, че учените нямат време да правят свои собствени корекции в генома. По този начин се създава омагьосан кръг: веригата, ремонтирана по нежелан начин, трябва да бъде прекъсната отново с протеина Cas9.
За да се предотврати това, изследователите модифицираха протеиновите ножици, за да създадат протеина TevCas9. Той разрязва нишката на ДНК на две места, което затруднява ремонта на сайта. За синтезиране на новия ензим, ензимът I-Tevl беше добавен към Cas 9, който също е ендонуклеаза, тоест протеин, който разцепва ДНК молекула в средата, вместо да се отцепва от краищата на последователността, както правят екзонуклеазите. Полученият синтетичен протеин се оказа по-точен при свързване към определени места и по-малко вероятно да сгреши и да отреже грешното място.
Кристална структура на Cas9, свързана с ДНК
Снимка: Уики проект Cas9 / Уикипедия
Има и друг начин за подобряване на точността на CRISPR системите. „Надпреварата във въоръжаването“между бактериите и вирусите доведе не само до развитието на защитни системи в микроорганизмите, но и до начини за тяхното неутрализиране. По този начин бактериофагите мутират бързо, губейки областите, по които бактериалният имунитет ги разпознава. Въпреки това, някои кодове за анти-CRISPR протеини, пречещи на работата на crRNA-Cas9 комплекса.
На 8 декември списание Cell публикува статия от учени от университета в Торонто, които създадоха „anti-CRISPR“- система, която ви позволява да изключите механизма при определени условия. Той предотвратява нежелани грешки, като потиска активността на Cas9 в случай, че водещата РНК се свърже с грешен фрагмент. Анти-CRISPR се състои от три протеина, които инхибират нуклеазата и са кодирани от гените на един от бактериалните вируси.
Вече технологията CRISPR се използва за лечение на сериозни заболявания като левкемия и рак на белия дроб, а също така се тества за пречистване на имунните клетки от ХИВ. Докато учените намират нови начини за подобряване на този метод, ще се разкриват все повече и повече възможности за неговото прилагане.
Александър Еникеев
