Проби от тъкани на мумиите под имената "Мария" и "Вавита" бяха изпратени от Перу в руска лаборатория за изследване. Предоставените проби от биологични тъкани бяха изследвани с помощта на сканираща електронна микроскопия, Раманов спектър, ICPE и беше изследван съставът на диатомовата земя (вещество върху повърхността на кожата на мумиите). Проведено е и изследване на ДНК на прехвърлените тъкани.
приготвяне на пробата
Пробите от тъкан, 500 μg всяка, се прехвърлят в пластмасови епруветки и се разтварят в 1 ml буфер (10 mM Tris-HCl рН = 10,5, 1 mM EDTA, 0,15 М NaCl). Към получените суспензии се добавя Na додецил сулфат към 0,5%, загрява се до +80 ° С и след 10 минути протеиназа К (до 500 μg / ml) се поставя в термостат (+55 ° С) за 24 часа.
Депротеинизацията се провежда по фенолен метод: добавяне на фенол в равен обем към суспензията, след това фенол: хлороформ (1: 1), хлороформ; след всяко прибавяне се извършва постоянно разбъркване на ъглов ротор и центрофугиране при 15 хиляди оборота в минута, 10 минути.
Към супер-утайката, получена след 3-то центрофугиране, се прибавя 1/10 част от обема на 1 М NaCl и 2,5 обема двукратно дестилиран етилов алкохол и се оставя за една нощ при -30 ° С в конусни епруветки - "Епендорф". Центрофугирането се извършва при 15 хил. Об. мин. в рамките на 10 минути и получената ДНК се "утаява" под формата на кафява утайка. ДНК пелетата се промива два пъти с 70% етилов алкохол и се суши при стайна температура (1 час) и след това се разтваря в ТУ буфер.
PCR се провежда на програмируем термичен цикъл "My Cycler" ("Био = Рад"), като се използват стандартни олигопримери, синтезирани по метода на твърдата фаза в асоциацията "Beagler" (Санкт Петербург). Реакционната смес за амплификация с обем 25 μL включва: 15 пМ от всеки олигопример, 67 тМ Tris-HCI pH = 8,8 при +25 ° С, 16,6 mM (NH4) SO4, 6,7 mM MgCl2, 6,7 µM EDTA, 10 mM 2 меркаптоетанол, 170 µg / ml BSA и смес от четири основни dNTPs в концентрация 1,0 mM всеки и термостабилна ДНК полимераза Thermus thermophilis (5 U / μl) (NPO SibEnzim). След денатурация (10 минути, 94 ° С) се извършват 35 амплификационни цикъла за всяка изпитвателна система: 94 ° С -1 мин, 58 ° С - 1 мин, 72 ° С - 1 мин. За да се контролира специфичността, в реакцията се въвеждат ДНК проби с известни генотипи за изследваните локуси (маркиращи системи), както и контролни проби.съдържаща смес от реагенти без ДНК. След амплификация се добавя оцветяващ буфер към аликвоти от реакционната смес (7 μl) и се отделя чрез вертикална електрофореза в 6% полиакриламиден гел (210x150x1 mm), оцветява се с етидиев бромид и се снима под ултравиолетова светлина. За идентифициране на алели са използвани алелни стандарти, съответстващи на тези локуси ("стълби").
Промоционално видео:
ДНК анализ
За изследването използвахме метода на анализа на екзома на човешката ДНК, основан на високопроизводително секвениране с обогатяване чрез хибридизация.
Техника на анализ на екзома на човешката ДНК.
Бяха анализирани 2 проби … Всички етапи от подготовката на пробата преди PCR бяха проведени в чисти помещения. Приготвяне на проби, екстракция на ДНК и амплификация на отделни ДНК фрагменти бяха извършени в различни помещения.
Специфични адаптери (комплект за подготовка на библиотеката на KAPA и адаптер за комплект SeqCap; Roche) се лигират до краищата на геномната фрагментирана ДНК (~ 5 ng), след което се извършва двустепенна селекция на фрагменти в диапазона от 200-350 bp с помощта на AMPureXP Beads (Beckman Coulter) … Получените фрагменти се амплифицират с специфични за адаптера праймери и се хибридизират с биотинилирани специфични сонди (NimbleGen SeqCap EZ Choice MedExome; Roche) в продължение на 28 часа при 47 ° С. В една реакция бяха обединени две ДНК проби. Биотинилирани проби-ДНК хибриди бяха изолирани и пречистени със стрептовидин конюгирани магнитни частици; извършено е второ амплифициране и качествена оценка на получената ДНК библиотека (TapeStation 4200; Agilent Technologies). За да се премахнат фрагментите за амплификация на извън целта и димери на адаптера, ДНК библиотеката се пречиства повторно с помощта на магнитни частици AMPureXP Beads (фиг. 1). Крайната концентрация на подготвената библиотека се оценява върху инструмент Quantus, използвайки търговски комплект QuantiFluor® dsDNA System (Promega). Получената ДНК библиотека се имобилизира върху повърхността на поточната клетка. Секвенирането беше извършено на платформата Illumina с използване на стандартна поточна клетка и MiSeq Reagent Kit v2 300 (2 × 150 цикъла). Получената ДНК библиотека се имобилизира върху повърхността на поточната клетка. Секвенирането беше извършено на платформата Illumina с използване на стандартна поточна клетка и MiSeq Reagent Kit v2 300 (2 × 150 цикъла). Получената ДНК библиотека се имобилизира върху повърхността на поточната клетка. Секвенирането беше извършено на платформата Illumina с използване на стандартна поточна клетка и MiSeq Reagent Kit v2 300 (2 × 150 цикъла).
Фигура: 1
Обща оценка на качеството на секвенирана ДНК
За първоначалната оценка на качеството бяха използвани стандартни методи като FastQC и програмите Jellyfish и KraTER. Оценката на качеството не показва проблеми с качеството при отчитането на секвенираната ДНК и за двете проби. Снимките не се показват, тъй като не са информативни.
За първата проба (по-нататък М, голяма мумия "Мария") бяха описани 113.4M четения, за втората проба (по-нататък W, малка мумия "WaWita") бяха описани 22.9M показания.
Следващата стъпка беше да се изчисти секвентираните четения от различни технически последователности, които биха попречили на по-нататъшния анализ. За това беше използвана програмата Cookiecutter. След почистване имаше 113.3M (99%) отчитания и 22.8M (99%) показания, съответно, за M и W.
Оценка на количеството древна ДНК и нейното отделяне от съвременната
Стандартният метод за оценка на присъствието и количеството на древна ДНК е да се оцени количеството на увредените във времето нуклеотиди. За това беше използвана програмата MapDamage 2.0. MapDamage 2.0, който показва количеството на древна ДНК в 30,1%, но тъй като MapDamage предполага, че използваме близка справка, и не знаем точно колко са близки и двете проби до генома на съвременните хора, и използвахме библиотека exome, самият този метод не беше достатъчна. Друг добър метод за оценка на древна ДНК е броят на късите фрагменти.
Филтрацията на предполагаемата древна ДНК става на три етапа. На първия етап премахнахме всички сдвоени четива, които не могат да бъдат пресечени и сглобени в едно неспарно четене с припокриване. Тези показания показват, че оригиналният фрагмент, който е секвенсиран, е по-дълъг от 300 bp. и най-вероятно съвременна ДНК. Така след тази стъпка са останали съответно 86,9% и 91,8%. След това бяха избрани единични припокрити фрагменти, така че дължината им да беше по-кратка от 150 bp, тъй като това е дължината, която очаквахме за древна ДНК. След този етап 8.6% и 38.5% остават съответно за проби M и W. Трябва да се отбележи, че въпреки разликата в процентите, абсолютният брой на показанията между пробите M и W е много сходен: 9.8M и 8.8M, което може да се обясни с факта, че съдържанието на древна ДНК в двете проби е сходно.
| параметър | Проба М (Мария) | Проба W (Wawita) |
| Брой четения | 113.3M | 22.8M |
| Процент къси фрагменти <300 bp | 86,9% | 91,8% |
|
Процент къси фрагменти <150 bp (брой) |
8,6% (9,846,035) |
38,5% (8 813 220) |
|
Процент фрагменти, подравнени на човешки геном (брой) |
2,03% (2,345,084) |
9,65% (2,264,551) |
| Процент фрагменти, подравнени на човешки геном от къси <150 bp | 23,8% | 25.6% |
Получаване на ДНК, подобна на референтния човешки геном
Получената предполагаема древна ДНК е картографирана на референтен човешки геном, използвайки стандартен тръбопровод за търсене на геномни варианти, използвайки BWA, samtools и Wcftools.
Освен това, само 23,8% от пробата М и 25,6% са били успешно картографирани в референтния геном на съвременните хора. В същото време и за двете проби 75% от секвенцираните показания не могат да бъдат картографирани върху човешкия геном. Това може да се обясни както със замърсяването, така и с факта, че тези проби са разположени достатъчно далеч от генома на съвременните хора. В същото време си струва да се има предвид, че сме секвенирали библиотеката на екзомите и по този начин минимизираме замърсяването на бактериалната ДНК.
Първоначалният разузнавателен анализ на неварени четения показа, че някои от тях принадлежат към повтаряща се ДНК, специфична за копитни животни, това може да се обясни с факта, че при мумифицирането се използва лама мазнина.
За по-подробен анализ са необходими около три седмици изчисления, тъй като съществуващите решения са направени само за вирусни и бактериални геноми и ние трябва да сравним с всички съществуващи геноми, включително растителни геноми, за да разберем кои видове са секвенцирани.
Характеристики на намерените опции
Картографираните показания бяха използвани за търсене на варианти, които отличават M и W пробите от съвременния човешки геном, както и за оценка на замърсяването на показанията от човешката Y хромозома.
Първият въпрос, на който трябваше да се отговори, беше на кои хромозоми бяха картографирани секвентираните показания.
Тъй като знаем, че пробите на Мария са изолирани от костите и мускулите, а Вавита - само от костите, очаквахме разлика в количеството на mtDNA. Но нямаше голяма разлика.
Броят на картографираните показания на Y е друг тест за заразяване от съвременните хора. Интересното е, че се оказа еднакво и в двете проби.
Статистиката за намерените варианти е показана по-долу:
| Параметри | Проба М (Мария) | Проба W (Wawita) |
| Брой намерени опции | 79957 | 48 941 |
| Брой опции на Y | 534 | 541 |
| Броят на надеждните опции (повече от 20 четения и над 30 качество) | 16969 | 6181 |
| Варианти с известен rsid (наличен в базата данни за фрагменти) | 5701 | 3089 |
| Общи валидни опции | 92 | |
| общи опции с rsid | 49 |
След това стана възможно да се отговори на въпроса: М и Ш роднини ли са? Отговорът е не.
Открити са само 49 съвпадащи варианта между M и W и 3040, различаващи се за варианти с известен rsid. Освен това, може би това са различни видове или подвидове на човек или непознато създание.
Интересното е, че вариантите с Y хромозома са идентични и за двете проби, което показва замърсяване от едно и също лице и че в древната ДНК на Y хромозомата вероятно все още няма хромозома.
Оценка на приликата със съществуващите секвенирани човешки геноми от проекта за човешки геном 1000
Обърнете внимание, че това е само приблизителен анализ, тъй като за по-точен анализ са необходими варианти от региони на генома при неутрална селекция и имаме данни за exome.
Въпреки това, използвайки 5708 варианта за М или 3096 за S, беше възможно да се извърши вариант на анализа в сравнение с данните за 1000 човешки генома.
Резултатът от PCA анализа на снимката по-долу е суперпозиция от две картини за M и W, изчислени отделно, тъй като има твърде малко общи опции между M и W, за да се изчислят разстоянията между M и W.
Оценка за сходство.
Както можете да видите, няма случайност с никоя група гени, те също се различават един от друг. Но трябва да се има предвид, че при селекцията използвахме кодиращи последователности и се препоръчва да се използват варианти при неутрален подбор.
Независимо от това, резултатът от PCA е в добро съгласие с ръчната проверка на вариантите, която показа, че данните са в неразбран хомозигот, което отново показва, че изображенията са далеч от съвременния човешки геном.
заключение
За съжаление, ние бяхме ограничени само до две проби, обикновено в този тип анализи се използват повече, поне 3-10, поне по някакъв начин свързани. Следователно е необходимо да се продължи изследването с голям брой проби.
В същото време можем най-вероятно да заключим, че ДНК пробите на Мария и Вавита съответстват на човешката ДНК, но не съвпадат с ДНК, достъпна за нас от база данни от 1000 души.
Автори на доклада: Баранов В. С. и Асеев М. В. (Научно-изследователски институт по акушерство и гинекология, Катедра по пренатална диагностика), Глотов А. С. и Глотов О. С. (Санкт-Петербургския държавен университет), А. С. Комисаров (Институт по цитология, Руска академия на науките, Център за генетична биоинформатика).
Материали, предоставени от Константин Георгиевич Коротков (доктор на техническите науки, професор, Университет по информационни технологии, механика и оптика) и Дмитрий Владиславович Галецки (кандидат на медицинските науки, И. П. Павлов Първи държавен медицински университет в Санкт Петербург).
За повече информация за мумиите от Nazca, вижте етикета: Nazca mummies.
