Изобретението на редактора на гени CRISPR-Cas се нарича революция в биологията. Учените обещават да го използват за подобряване на сортовете растения и породите животни за селското стопанство, за лечение на вродени генетични заболявания при хората. Кореспондентът на РИА Новости отиде да види кой и как се редактира генома.
Центърът за редактиране на геноми на Московския държавен университет отвори преди малко повече от година - в кампуса. Среща ме директорът му, доктор по химия Петър Сергиев и докато се возим в асансьора, той посвещава малко на историята на генното инженерство.
„Геномът е бил редактиран преди. Но беше трудно да се създадат инструменти за това, отне много време и резултатът често не беше такъв, какъвто го искахме “, казва той.
Във вивариума Петър Владимирович се преоблича в сини лабораторни дрехи, дават ми бял гащеризон за еднократна употреба и ме молят да избърша камерата с алкохол. Сега Петър Владимирович изглежда като хирург, а аз - като лаборант от сериала "CSI - местопрестъпление".
В стерилната лаборатория за нас са подготвени контейнер с оплодени мишки яйца и епруветка с разтвор на РНК. Това е всичко, което ви е необходимо за редактиране на генома CRISPR-Cas.
CRISPR е английски акроним за фраза, която буквално означава „редовно групирани кратки палиндромни повторения“. Всъщност това са само малки участъци от ДНК на бактериофагични вируси, вградени в бактериалния геном. Тези последователности са необходими за функционирането на имунната система на бактериите и служат като своеобразно съобщение за „полицията, искано“. Ако бактерията оцелее след инфектиране с бактериофаг, тя използва ензимите Cas протеин, за да отреже парче от своята ДНК и да го вмъкне в генома си, за да бъде разпознат по-късно. Бактериалният геном наследява тази библиотека от „врагове“, внимателно събрана от предишни поколения.
През 2013 г. учените откриха, че протеинът Cas действа във всеки организъм, включително и бозайници. Той е в състояние да направи насочени разкъсвания в двете нишки на молекулата на ДНК и по този начин да промени генома.
Промоционално видео:
Манипулация с яйца
Петър Сергиев прави стъклен капиляр с диаметър от сто микрона при микро ковашката, изтегля яйцето в него и го пренася под стъкло с хранителна среда. Готовата проба се изпраща до етапа на оптичния микроскоп. Мониторът показва увеличено изображение на яйцето, треперещо на върха на капиляра. Две заоблени петна се открояват - това са пронуклеиди с ДНК на майката и бащата.
Ученият подготвя друг капиляр с порядък по-малък диаметър. Това е инжекционна спринцовка. Той събира разтвор с два вида РНК в него и с помощта на манипулатори нежно пробива яйцето. Това е, инжекцията се прави.
РНК, инжектирана в яйцето, е необходима за изрязване на генома на дадено място. Един вид РНК съдържа строго определена последователност от нуклеотиди, подобна на тази, която възнамерявахме да променим. Задачата на тази РНК е да намери съответния регион в ДНК, затова се нарича "водач". РНК от втория тип, матрица, е един вид инструкция за синтеза на Cas9 нуклеазен протеин. Този протеин действа като катализатор на химическа реакция, която разрушава фосфодиестерните връзки между добре дефинираните ДНК бази. Тъй като протеиновата молекула има два нуклеазни центъра, и двете нишки на ДНК се отварят, освен това, на мястото, чиито координати Cas9 "преброяват" с водача РНК.
ДНК молекулата възприема разрушаването в двете направления като сериозно разпадане и се стреми да го поправи. Ензонуклеазните ензими, плаващи в клетката, незабавно отстраняват няколко нуклеотида от двата края на разкъсването. Това е достатъчно, за да се счупи или, както казват генетиците, „да изключи“ген.
Как работи генетичният редактор на CRISPR-Cas9 / Илюстрация от РИА Новости. Алина Полянина.
Ако е необходима насочена мутация, например, е необходимо да се маркира протеин, за да се проследи в тялото, тогава към комплекса се добавя друг шаблон под две РНК под формата на специално проектирана ДНК. Той се състои от последователности, идентични на краищата на бъдещото счупване, и също така съдържа секцията, която трябва да бъде вмъкната. След като Cas9 е разрязал молекулата на ДНК, нейните краища са свързани с помощта на този допълнителен шаблон, така че наборът нуклеотиди, от които се нуждаем, се вмъква в разкъсването.
„Можем да прикрепим малка опашка към катеричката, с която е удобно да я извадим и да видим с какво взаимодейства. Можем да вмъкнем ген, но той не е толкова ефективен, колкото изключването му “, продължава да обяснява ученият.
ГМО и химери
Редактираното яйце ще бъде трансплантирано в маточната тръба на сурогатна мишка. Живяла известно време с мъжкар, чиито семенни канали са вързани. Двойката имаше нормален сексуален живот, но не можеше да зачене. Въпреки това тялото на мишката вярваше, че е бременна, и формира подходящия хормонален фон за нея. Сега тази женска носи нечий друг плод.
След три седмици тя ще роди най-обикновените мишки. Учените ще изчакат, докато гризачите пораснат, ще вземат малко парче от опашката си и ще използват PCR за анализ на парчето ДНК, което са редактирали. Мутацията или гена с увреждания се срещат в повече от половината от случаите. Обратната процедура - вмъкване на последователност в генома - успява за не повече от 10% от експериментите.
При редактирането се появяват различни интересни ефекти. Например се раждат мозаечни мишки или химери, които имат клетки с различни вариации на геномите на майката и бащата. Cas9 може да отреже ДНК много пъти, но месинджърната РНК, която го кодира, не е вечна и инжектираният разтвор просто изчезва при поредица от клетъчни деления. Понякога редакторът все още се запалва, след като пронуклеидите са се слели и яйцето е споделило. И тъй като възстановяването на ДНК след разрушаване винаги е случаен процес и изцелението никога не се случва по същия начин, тогава някои от клетките в един организъм ще съдържат друга мутация.
За науката и медицината
Преминаваме в съседната стая, за да гледаме резултатите на живо от експериментите за редактиране на геноми. На рафтовете вляво - контейнери с генетично модифицирани мишки, вдясно - с общи гризачи за контрол. Те бяха отгледани, като тези отляво, но геномът не беше манипулиран. Контролните мишки са необходими, за да имаме норма пред очите ни и да сравним получените в експеримента създания с нея.
Петър Сергиев взема един от контейнерите с чифт сиви мишки. Външно те са напълно обикновени, но нямат потомство. Факт е, че при мъжете генът на една от РНК метилтрансферазите, ензим, произведен само в сперматозоидите, е изключен. Мъжките с неактивен ген се раждат стерилни. Точната цел на гена и ензима все още не е известна. За да разберете, в лабораторията са разведени два щама мишки: единият е изключил ген, а другият е имал протеин, маркиран с геномен редактор.
„Мутация в този ген се среща и при хората - тогава човек страда от безплодие. Но докато не разберем защо е необходима, защо модифицира РНК, няма да можем да помогнем на такива пациенти “, разсъждава ученият.
Всъщност все още не знаем функцията на повечето човешки гени. Откриването на това е основна задача, решена от много изследователски групи по целия свят, включително в Русия. Геномът на мишката е много подобен на този на хората. Надяваме се, че с помощта на CRISPR-Cas изследването на генома на всяко същество ще продължи по-бързо.
Групата на Сергиев заедно с Н. Н. Н. Н. Петрова се зае да търси мутации, водещи до някои видове рак. Най-близките планове включват проект за създаване на генетично модифицирани животни за селското стопанство в сътрудничество с Всеруския научноизследователски институт по животновъдство и Института по генна биология на Руската академия на науките.
„CRISPR-Cas е фантастичен инструмент, който ви позволява да промените генома по свое усмотрение, за да бъдете малко бог. В крайна сметка задачата на науката е да разбере как работи толкова сложно същество като бозайник “, казва ученият.
Решаването на фундаментални проблеми на науката е чудесно, но какво ще даде тази технология на медицината? В обозримо бъдеще, уви, не много. Лесно е да се редактира яйце и да се отгледа генетично модифицирана мишка, но е невъзможно да се коригират гените на възрастно животно, камо ли на човек.
Методите за редактиране на ДНК в соматични (тоест вече формирани клетки) все още са много неефективни. За да въведете в клетка някакъв ген, изключен чрез мутация и да го принудите да произвежда определен протеин, трябва да премахнете част от клетките от тялото, да редактирате ДНК в тях и да го върнете обратно в тялото. По принцип има надежда, че по този начин ще бъде възможно да се преборим със заболявания като мускулна дистрофия на Дюшен или муковисцидоза, когато е необходимо да се възстанови работоспособността на някаква част от клетките. Що се отнася до предразположението към рак, засега геномният редактор е безсилен. Ако мутантният ген се открие в човек, то той се намира във всички клетки на тялото. Нереалистично е да ги промените. И всяка клетка с мутация е източник на опасност.
Но дори CRISPR / Cas да помогне да отговори само на някои основни въпроси и да позволи лечението на редки генетични заболявания, това ще бъде голяма крачка напред за човечеството.
Татяна Пичугина
